如何選擇合適熒光蛋白？

自 1992 年綠色熒光蛋白被用于標(biāo)記基因，各種顏色的熒光蛋白被開發(fā)出，目前有上百種的熒光蛋白。在我們的實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)常會(huì)用到熒光蛋白，但是如何選擇合適熒光蛋白，得到完美的實(shí)驗(yàn)結(jié)果？相信這個(gè)問題一直困擾著大家，鑒于此，小編從不同的角度去考慮如何選擇熒光蛋白，希望可以給大家在選擇熒光蛋白方面提供一些幫助。
單體性質(zhì)將熒光蛋白與目標(biāo)蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，直接地追蹤目標(biāo)蛋白或是定位目標(biāo)蛋白，這就要求熒光蛋白是單體，不能影響目標(biāo)蛋白的功能和定位。因此，我們將熒光蛋白的單體性質(zhì)放在位。

目前體外檢測(cè)熒光蛋白單體性質(zhì)的方法有分子篩、沉降平衡，可以通過熒光蛋白分子篩的峰圖是否狹窄，單一粗略的判斷其是否為單體，沉降平衡能夠更加準(zhǔn)確的確認(rèn)其聚合性質(zhì)。我們使用熒光蛋白幾乎都是在細(xì)胞內(nèi)或組織內(nèi)，因此我們更加關(guān)心在生理?xiàng)l件下，熒光蛋白的聚合性質(zhì)。

科學(xué)家巧妙地將熒光蛋白與細(xì)胞色素 P450 進(jìn)行融合表達(dá)，讓熒光蛋白定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的胞質(zhì)面，熒光蛋白的聚合性質(zhì)會(huì)使鄰近的熒光蛋白聚合在一起，形成聚集體，在激光共聚焦顯微鏡下能夠看到細(xì)胞核的周圍有很大的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)。小編已經(jīng)用此種方法檢測(cè)了多個(gè)熒光蛋白。

綠色熒光蛋白(GreenFluorescent Protein，簡稱GFP）是在美國西北海岸所盛產(chǎn)的一種名為Aequorea victoria的水母中發(fā)現(xiàn)的一種可以發(fā)出綠色熒光的蛋白質(zhì)。GFPzui早是在1962年由日本科學(xué)家下村修發(fā)現(xiàn)，是由238氨基酸組成的單體蛋白質(zhì)，蛋白分子量約為27kD。GFP的晶體結(jié)構(gòu)顯示，蛋白質(zhì)中央是一個(gè)圓柱形水桶樣結(jié)構(gòu)，長420nm，寬240nm，由11個(gè)圍繞中心α螺旋的反平行β折疊組成，桶的頂部由3個(gè)短的垂直片段覆蓋，底部由一個(gè)短的垂直片段覆蓋，對(duì)熒光活性很重要的生色團(tuán)則位于桶的大空腔內(nèi)。實(shí)驗(yàn)表明GFP熒光產(chǎn)生的前提是桶狀結(jié)構(gòu)完整性，去除N端6個(gè)氨基酸或C端9個(gè)氨基酸，GFP均會(huì)失去熒光。原因是GFP生色團(tuán)的形成效率較低，而且形成過程受外界環(huán)境影響較大。

發(fā)光原理：
GFP的第65至67位的三個(gè)氨基酸（絲氨酸-酪氨酸-甘氨酸）殘基，可自發(fā)地形成一種熒光發(fā)色團(tuán)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)鏈折疊時(shí)，這段被深埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部的氨基酸片段，得以“親密接觸”，導(dǎo)致經(jīng)環(huán)化形成咪唑酮，并發(fā)生脫水反應(yīng)。在分子氧存在的條件下，發(fā)色團(tuán)可進(jìn)一步發(fā)生氧化脫氫，zui終成熟，形成可發(fā)射熒光的形式。具體過程為：在 O2存在下，GFP分子內(nèi)第67位甘氨酸的酰胺對(duì)第65位絲氨酸的羧基進(jìn)行親核攻擊，形成第5位碳原子咪唑基；第66位酪氨酸的α2β鍵脫氫反應(yīng)之后，導(dǎo)致芳香團(tuán)與咪唑基結(jié)合，并zui終自發(fā)催化形成對(duì)羥基苯甲酸咪唑環(huán)酮生色。

GFP需要在氧化狀態(tài)下產(chǎn)生熒光，強(qiáng)還原劑能使GFP轉(zhuǎn)變?yōu)榉菬晒庑问?，但一旦重新暴露在空氣或氧氣中，GFP熒光便立即得到恢復(fù)。一般來說弱還原劑并不會(huì)影響GFP熒光，中度氧化劑如生物材料的固定，脫水劑戊二酸或甲醛等對(duì)GFP熒光影響也不大。

發(fā)光特性：
GFP吸收的光譜zui大峰值為395nm（紫外），并有一個(gè)峰值為470nm的副吸收峰（藍(lán)光）；發(fā)射光譜zui大峰值為509nm（綠光），并帶有峰值為540nm的側(cè)峰（Shouder）。雖然450～490nm只是GFP的副吸收峰，但由于該激發(fā)光對(duì)細(xì)胞的傷害更小，因此通常多使用該波段光源（多為488nm）。此外，GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽（FITC）很相似，兩者通常共有一套濾光片。GFP熒光極其穩(wěn)定，在激發(fā)光照射下，GFP抗光漂白（Photobleaching）能力比熒光素強(qiáng)，特別是在450～490nm藍(lán)光波長下更穩(wěn)定。類似的，GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠(yuǎn)比熒光素標(biāo)記的熒光抗體高，抗光漂白能力強(qiáng)，因此更適用于定量測(cè)定與分析。由于GFP熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應(yīng)底物，因此GFP作為一種廣泛應(yīng)用的活體報(bào)告蛋白，其作用是任何其它酶類報(bào)告蛋白無法比擬的。但因?yàn)镚FP不是酶，熒光信號(hào)沒有酶學(xué)放大效果，因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報(bào)告蛋白，比如螢火蟲熒光素酶等。

變體：
在GFP發(fā)現(xiàn)的半個(gè)世紀(jì)中，陸續(xù)衍生了多個(gè)變體，其中zui的要屬其紅移變體——增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced GFP，EGFP；EGFP的zui大吸收峰位于488nm）。其他還包括發(fā)射熒光也發(fā)生改變的變體，包括藍(lán)色熒光蛋白：EBFP，EBFP2，Azurite，mKalama；青色熒光蛋白：ECFP，Cerulean，CyPet；黃色熒光蛋白：YFP，Citrine，Venus，YPet等等

小編發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白中，單體性質(zhì)比較好的是 mEmerald，該蛋白很少形成大的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，并且目前還沒有稱該蛋白會(huì)影響定位的報(bào)道。
此外 mEmerald 是一個(gè)非常穩(wěn)定的綠色熒光蛋白，因此可以用于線性的結(jié)構(gòu)光照明超分辨熒光顯微成像。

我們還發(fā)現(xiàn)紅色熒光蛋白中沒有一個(gè)單體性質(zhì)特別好，相比較來說，mApple 的單體性質(zhì)zui好，但是在使用該蛋白的過程中，發(fā)現(xiàn) mAppple 會(huì)影響某些蛋白的定位，因此在使用紅色熒光蛋白時(shí)，要謹(jǐn)記紅色熒光蛋白可能會(huì)影響目標(biāo)蛋白的定位。

PK 值每個(gè)熒光蛋白都有其zui合適的 pH 值，即在一定的 pH 值下，熒光強(qiáng)度zui高。有的熒光蛋白適合在酸性環(huán)境下使用，相反有的適合在堿性環(huán)境下使用，因此在選擇熒光蛋白時(shí)需要考慮熒光蛋白的 PK 值。
在細(xì)胞內(nèi)，大多數(shù)細(xì)胞器內(nèi)及細(xì)胞質(zhì)的 pH 值都在 7.0 左右，然而溶酶體內(nèi)的 pH 值就比較低，因此常規(guī)的熒光蛋白并不適合用于標(biāo)記溶酶體內(nèi)的蛋白。

mCherry 的 PK 值比較低，適合在酸性的環(huán)境下使用，可以用于標(biāo)記溶酶體內(nèi)的蛋白，但是該熒光蛋白有一定的二聚性質(zhì)，可能會(huì)影響目標(biāo)蛋白的定位，在使用該熒光蛋白時(shí)要綜合考慮單體性質(zhì)和 PK 值。

在選擇熒光蛋白時(shí)，要考慮目標(biāo)蛋白定位環(huán)境的 pH 值，再考慮使用相應(yīng) PK 值的熒光蛋白。同時(shí)也可以考慮利用熒光蛋白的 PK 值的特性，幫助我們解決問題。

成熟時(shí)間熒光蛋白在發(fā)光之前需要經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄、翻譯、折疊等步驟，其中折疊過程占據(jù)了大部分時(shí)間，我們將此過程稱之為成熟時(shí)間。在標(biāo)記短壽命的目標(biāo)蛋白時(shí)，如果熒光蛋白的成熟時(shí)間太長，可能會(huì)出現(xiàn)在目標(biāo)蛋白開始降解時(shí)，熒光蛋白還沒有發(fā)光，導(dǎo)致無法追蹤及定位目標(biāo)蛋白。因此在選擇熒光蛋白時(shí)，需要考慮其成熟時(shí)間。

小編在實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，mEmerald、Dendra2 的成熟時(shí)間比較快，在用 Lipo2000 轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染 U2OS 細(xì)胞時(shí)，轉(zhuǎn)染后四個(gè)小時(shí)就能夠用熒光顯微鏡觀察到了熒光信號(hào)，EGFP 沒有信號(hào)。但是在用 P450 方法檢測(cè)時(shí)，Dendra2 會(huì)形成很大的聚集，表明該熒光蛋白的單體性質(zhì)不好，有可能影響目標(biāo)蛋白的定位和功能，在使用該蛋白的過程中應(yīng)該注意這個(gè)特性。

為了能夠更早地觀察某些短壽命熒光蛋白的生理特性和定位情況，科學(xué)家正在發(fā)展成熟時(shí)間更快的熒光蛋白，并且用于超分辨成像。

光穩(wěn)定性熒光蛋白在發(fā)光的同時(shí)會(huì)被漂白，逐漸失去發(fā)光能力，因此要想獲得更多的信息，就需要熒光的光穩(wěn)定性好。在普通的熒光成像中，對(duì)熒光蛋白的光穩(wěn)定性要求并不是很高，比如激光共聚焦顯微鏡成像時(shí)，熒光信號(hào)的穩(wěn)定性只需要能保證采集的完整的一張圖即可。

在超分辨熒光成像中，對(duì)熒光蛋白的光穩(wěn)定性要求比較高。線性結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡要求熒光蛋白始終處于亮的狀態(tài)，需要通過結(jié)構(gòu)光采集多幅圖進(jìn)行重構(gòu)；非線性結(jié)構(gòu)光顯微鏡則要求熒光蛋白在黑亮之間進(jìn)行多次切換，這就要求熒光蛋白能進(jìn)行反復(fù)的光調(diào)控，并且依舊維持著高的亮度；與非線性結(jié)構(gòu)光顯微鏡一樣，可逆飽和光線性熒光轉(zhuǎn)移顯微鏡也要求熒光蛋白能夠在黑亮之間進(jìn)行反復(fù)的光調(diào)控。

優(yōu)化密碼子大多數(shù)熒光蛋白是來自于海洋生物，因此密碼子偏好性與所要標(biāo)記蛋白的物種有較大的差異，這種密碼子偏好性差異可能會(huì)導(dǎo)致熒光蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中的表達(dá)量極低，以至于看不到熒光信號(hào)。

幸運(yùn)的是大多數(shù)熒光蛋白的密碼子已經(jīng)經(jīng)過優(yōu)化，適合在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行融合表達(dá)。但是當(dāng)需要使用熒光蛋白在其他種屬細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，應(yīng)考慮一下密碼子偏好性。

小編在進(jìn)行線蟲熒光成像時(shí)，就遇到過此類問題，沒有優(yōu)化密碼子時(shí)，熒光蛋白的表達(dá)量比較弱，在熒光蛋白經(jīng)過密碼密碼子優(yōu)化，并且在 DNA 序列之間插入線蟲的內(nèi)含子后，熒光蛋白的表達(dá)量得到了較大的提高。

在比較少見的物種進(jìn)行熒光成像時(shí)，需要把密碼子優(yōu)化這個(gè)特性考慮在內(nèi)。

N 端或 C 端在選擇了相應(yīng)的熒光蛋白后，我們需要確定把目標(biāo)蛋白放在熒光蛋白的 N 端或是 C 端。N 端與 C 端的區(qū)別在于目的蛋白，有的目的蛋白對(duì)這個(gè)要求不高，但某些目的蛋白就要求在特定的位置進(jìn)行融合表達(dá)。

熒光蛋白與目的蛋白融合表達(dá)可能會(huì)影響目的蛋白的折疊，這取決于目的蛋白折疊過程中，熒光蛋白所在的那一端有沒有參與蛋白質(zhì)的折疊。

例如，如果目的蛋白的 C 端會(huì)被折疊入目的蛋白的內(nèi)側(cè)，那么我們把熒光蛋白標(biāo)記在目的蛋白的 C 端，將獲得不到熒光信號(hào)；有些目的蛋白在后翻譯的過程會(huì)切掉一段，如果熒光蛋白處于被切的一端，那么就不能獲得準(zhǔn)確的目的蛋白的定位信息。

如果標(biāo)記的目的蛋白是一個(gè)新的蛋白，我們建議分別進(jìn)行 N 端和 C 端融合表達(dá)，以此來確定哪一個(gè)是zui好的選擇。除此之外，還可以用免疫熒光來確認(rèn)目的蛋白定位是否與熒光蛋白融合表達(dá)的一致。

綜合以上的介紹，在我們選擇熒光蛋白時(shí)，首要考慮的是熒光蛋白的聚合性質(zhì)，即是否會(huì)影響目的蛋白的功能及定位，其次是熒光蛋白的 PK 值是否與目的蛋白所處的環(huán)境的 pH 值相匹配，然后是熒光蛋白的成熟時(shí)間以及目的蛋白的壽命，綜合兩者決定熒光蛋白是否合適，zui后考慮熒光蛋白的光穩(wěn)定性、密碼子偏好性是否合適，zui后考慮目的蛋白放的位置，熒光蛋白是否會(huì)影響目的蛋白的功能及定位。

此外，在進(jìn)行熒光成像時(shí)，需要考慮顯微鏡所選的濾光片是否與相應(yīng)的熒光蛋白質(zhì)配套，顯微鏡的各種參數(shù)是否合適。值得提醒的是，激發(fā)光的強(qiáng)度不能太高，否則會(huì)導(dǎo)致熒光信號(hào)的漂白。