核酸分子雜交的類(lèi)型和分子雜交方法

核酸分子雜交的類(lèi)型

隨著基因工程研究技術(shù)的迅猛發(fā)展，新的核酸分子雜交類(lèi)型和方法在不斷涌現(xiàn)和完善。核酸分子雜交可按作用環(huán)境大致分為固相雜交和液相雜交兩種類(lèi)型。固相雜交是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，一條反應(yīng)核酸游離在溶液中。固體支持物有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、乳膠顆粒、磁珠和微孔板等。液相雜交所參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中。

由于固相雜交后，未雜交的游離片段可容易地漂洗除去，膜上留下的雜交物容易檢測(cè)和能防止靶DNA自我復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，故該法為常用。常用的固相雜交類(lèi)型有：菌落原位雜交、斑點(diǎn)雜交、狹縫雜交、Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、組織原位雜交和夾心雜交等。

液相雜交是一種研究早且操作復(fù)合的雜交類(lèi)型，在過(guò)去的30年里雖有時(shí)被應(yīng)用，但總不如固相雜交那樣普遍。其主要原因是雜交后過(guò)量的未雜交探針在溶液中除去較為困難和誤差較高。近幾年由于雜交檢測(cè)技術(shù)的不斷改進(jìn)，商業(yè)性基因探針診斷盒的實(shí)際應(yīng)用，推動(dòng)了液相雜交技術(shù)的迅速發(fā)展。下面對(duì)固相雜交和液相雜交分別進(jìn)行介紹。

（一）固相膜核酸分子雜交方法

固相核酸雜交多是在膜上進(jìn)行，因此，以下主要介紹固相膜的核酸分子雜交方法：

1．DNA的變性　

DNA變性解鏈?zhǔn)请s交成功的關(guān)鍵。Southern印跡雜交時(shí)DNA在凝膠中變性，變性方法是將凝膠浸在數(shù)倍體積的1.5mol/l NaCl和0.5mol/l NaOH中1h然后用數(shù)倍體積的1mol/l Tris –HCl(Ph8.0)和1.5mol/l NaCl溶液中和1h。DNA受酸、堿、熱等處理均能發(fā)生變性，但強(qiáng)酸會(huì)使核酸降解。一般認(rèn)為堿變性較好，可避免DNA降解。熱變性在要低DNA濃度（100μg/ml）和低鹽濃度（0.1mol/l SSC 含15mmol/l NaCl - 1.5mmol/L檸檬酸三鈉，pH7.0）下進(jìn)行。用SSC稀釋DNA溶液為50μg/ml,加10mol/l NaOH使終濃度為0.1mol/L（pH約12.8），室溫變性10min，很快置冰鹽水中，用10min/l HCl或5mol/l NaH2PO4調(diào)pH到7～8[亦可用堿變性后，調(diào)至中性，再加熱100。c 10min]，DNA變懷可用OD260增加（約30%～40%）來(lái)檢測(cè)，變性DNA醇沉淀呈雪樣，完全失去纖維狀沉淀。變性后加入等量冷的12×SSC，冰浴保存。

2．變性DNA在硝酸纖維素膜上的固定　

硝酸纖維素濾膜（孔徑0.45μm）先在蒸餾水中充分浸泡，再用6×SSC浸泡30min～2h，涼干。DNA樣品轉(zhuǎn)移或加至硝酸纖維素膜上后，先室溫干燥4h，然后在80度真空干燥2h或者在254nm紫外交聯(lián)儀用120mj能量固膜。

3．預(yù)雜交　

濕潤(rùn)的濾膜放入可加熱封口的塑料袋中，按每平方厘米濾膜加0.2ml預(yù)熱至60。C的預(yù)雜交液（6×SSC，0.5%,SDS,5×Denhardt液，100μg/ml鮭魚(yú)精DNA）。鮭魚(yú)精DNA需經(jīng)過(guò)剪切和DNA酶消化處理，然后酒精沉淀純化，調(diào)濃度至10mg/ml，用前放100。C水浴中煮沸變性10min，冰水驟冷。盡可能將袋中氣泡趕盡，可封口器將袋口封住。將雜交袋浸入68度水浴保溫3~12h。當(dāng)預(yù)雜交液溫度升至68度時(shí)，在濾膜表面常會(huì)形成小氣泡。輕輕晃動(dòng)袋中液體即可除去這些小氣泡，這一點(diǎn)對(duì)于保證濾膜表面充分浸潤(rùn)預(yù)雜交液很重要。

4．雜交　

從水浴中取出塑料袋，用剪刀剪開(kāi)一角，盡可能擠凈預(yù)雜交液。用吸管或大槍頭將雜交液加入袋中，用恰好是足量的液體保持濾膜濕潤(rùn)（50μl/cm2）。溶液的組成是6×SSC，0.01mol/l EDTA, 變性的標(biāo)記核酸探針，5×Denhardt液，0.5%SDS, 100μg/ml變性的鮭魚(yú)精DNA。盡可能趕盡氣泡后，將塑料袋嚴(yán)密封口，在分子雜交儀內(nèi)進(jìn)行雜交反應(yīng)在68℃水浴中進(jìn)行，所需時(shí)間視探針和檢測(cè)靶DNA的性質(zhì)及探針的比活性等情況而定，一般4～20h。

5．洗膜　

取出塑料袋，用剪刀剪開(kāi)，小心取出濾膜，立即浸入盛有2×SSC和0.5%SDS溶液的盤(pán)中，室溫下漂洗5min。再將濾膜移入2×SSC和0.1%SDS溶液中，室溫下洗滌15min（輕輕搖動(dòng)）。然后將濾膜移入0.1×SSC和0.5%SDS溶液中；68℃輕輕搖動(dòng)保溫2h，更換緩沖液后繼續(xù)保溫30min。

洗膜的溫度一般應(yīng)控制在低于Tm值12℃以上。（Tm = 69.3 + 0.41x(G +C) %）。雙鏈DNA的Tm值隨錯(cuò)配堿基對(duì)數(shù)每增加1%而遞減1℃。

6．結(jié)果顯示　非放射性檢測(cè)方法前已述及，此處主要介紹放射性測(cè)定方法。固相膜的放射性雜交結(jié)果顯示有兩種方式，一是放射性自顯影法，另一種是液閃計(jì)數(shù)法。前一種方法比較簡(jiǎn)單，只需將雜交膜與X光片在暗盒中曝光數(shù)小時(shí)至數(shù)天，再顯影、定影即可。對(duì)于雜交信號(hào)較弱的固相膜，用一塊增感屏可顯著增強(qiáng)曝光強(qiáng)度。此外，為了減弱32P的散射，曝光通常在-20℃或-80℃下進(jìn)行。液閃計(jì)數(shù)法主要用于打點(diǎn)和狹縫雜交及為了比較兩個(gè)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱等情形。方法是將完成雜交的膜在漂洗結(jié)束后剪成小塊（每份樣品1塊），80℃真空干燥后裝閃爍瓶。加入2～5ml閃爍液，剪2～3塊無(wú)樣品膜塊作為本底對(duì)照。在液體閃爍計(jì)數(shù)器上自動(dòng)計(jì)數(shù)。液體計(jì)數(shù)測(cè)定放射性強(qiáng)度也可在放射自顯影之后進(jìn)行。

（二）固相核酸分子雜交類(lèi)型

1．菌落原位雜交（Colony in situ hybridization）　

菌落原位雜交是將細(xì)菌從培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA。將NDA烘干固定于膜上與32P標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測(cè)菌落雜交信號(hào)，并與平板上的菌落對(duì)位。

實(shí)驗(yàn)步驟如下：

①將硝酸纖維素濾膜置于含抗生素的平皿瓊脂培養(yǎng)基上，用無(wú)菌牙簽挑取單菌落種于濾膜和主瓊脂平板上，排列成方格柵，膜和板上菌落位置相同。

②培養(yǎng)細(xì)菌至產(chǎn)生1～2mm大小的菌落。

③在一塊平皿中置4張濾紙，用10%SDS浸透，倒掉多余液體。將帶有菌落的濾膜取下，輕輕置于濾紙上，菌落面上在，注意防止在濾膜底面存有氣泡。

④5min后，將濾膜轉(zhuǎn)至用變性溶液（0.5mol/l NaCl , 0.5mol/L Tris·NaCl）浸濕的濾紙上，放置10min。

⑤將濾膜轉(zhuǎn)至中和溶液（1.5mol/l NaCl , 0.5mol/L Tris·HCl ，pH8.0）浸濕的濾紙上，放置10min。重復(fù)中和1次。

⑥將濾膜移至用2×SSPE溶液浸過(guò)的濾紙上，放置10min。SSPE配成20×貯備液：3.6mol/l NaCl, 0.2mol/L NaH2PO4(PH7.4), 20mmol/L EDTA(pH7.4)。

⑦將濾膜用濾紙吸干，80℃真空烘干2h。

以下操作參考前述。

2．斑點(diǎn)雜交（Dot blot） 

斑點(diǎn)雜交法是將被檢標(biāo)本點(diǎn)到膜上，烘烤固定或用紫外交聯(lián)儀輻照固定。這種方法耗時(shí)短，可做半定量分析，一張膜上可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品。為使點(diǎn)樣準(zhǔn)確方便，市售有多種多管吸印儀（manifolds），如Minifold I和II、Bio-Dot (Bio –Rad )和Hybri –Dot,它們有許多孔，樣品加到孔中，在負(fù)壓下就會(huì)流到膜上呈斑點(diǎn)狀或狹縫狀，反復(fù)沖洗進(jìn)樣孔，取出膜烤干或254nm紫外交聯(lián)儀內(nèi)紫外線(xiàn)照射以固定標(biāo)本，這時(shí)的膜就可以進(jìn)行雜交。

（1）DAN斑點(diǎn)雜交

①先將膜在水中浸濕，再放到15×SSC中。

②將DNA樣品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。

③用鉛筆在濾膜上標(biāo)好位置，將DNA點(diǎn)樣于膜上。每個(gè)樣品一般點(diǎn)50μl（2～10μg DNA）。

④將膜烘干，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）RNA斑點(diǎn)雜交：

RNA斑點(diǎn)雜交與上法類(lèi)似，每個(gè)樣品至多加10μg總RNA（經(jīng)酚/氯仿或異硫氰酸胍提取純化）。方法是將RNA溶于5μlDEPC水，加15μl甲醛/SSC緩沖液（10×SSC中含0.15mol/l 甲醛）使RNA變性。然后取5～8μl點(diǎn)樣于處理好的濾膜上，烘干。

培養(yǎng)細(xì)胞，標(biāo)本處理技術(shù)可以簡(jiǎn)化，不用提取和純化RNA。方法是用含0.5%Nonidet P40的低滲緩沖液對(duì)多種動(dòng)物細(xì)胞作簡(jiǎn)單處理，離心去掉細(xì)胞核和細(xì)胞碎片，就得到基本不帶DNA而富含RNA的細(xì)胞質(zhì)提取物，這一粗RNA在高鹽下用甲醛變性，不需加工直接點(diǎn)到硝酸纖維素膜上。本法可以快速檢測(cè)大量標(biāo)本，而只需極少量的細(xì)胞（5×104）或組織。

整個(gè)RNA實(shí)驗(yàn)中，要防止激活內(nèi)源性RNase，有許多種預(yù)防措施，有一種是在樣品中加入核糖核苷氧礬基復(fù)合物（RVC）。

（3）完整細(xì)胞斑點(diǎn)雜交：應(yīng)用類(lèi)似檢測(cè)細(xì)菌菌落的方法，可以對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物的特異序列進(jìn)行快速檢測(cè)。將整個(gè)細(xì)胞點(diǎn)到膜上，經(jīng)NaOH處理，使DNA暴露、變性和固定，再按常規(guī)方法進(jìn)行雜交與檢測(cè)。有人曾用此法從105個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞中檢測(cè)到少至5pg 的Epstein – Barr病毒DNA。完整細(xì)胞斑點(diǎn)印跡法可以用于篩選大量標(biāo)本，因?yàn)樗鞘辜?xì)胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法還高，又不影響與32P標(biāo)記的探針雜交。但它不適于非放射性標(biāo)記探針，因?yàn)镈NA純度不夠，會(huì)產(chǎn)生高本底。

3．Southern印跡雜交（southern blot ）　　

Southern blot 是研究DNA圖譜的基本技術(shù)，在遺傳診斷DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價(jià)值。Southern印跡雜交基本方法是將DNA標(biāo)本用限制性?xún)?nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段，然后經(jīng)堿變性，Tris緩沖液中和，高鹽下通過(guò)毛吸作用將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素濾膜上，烘干固定后即可用于雜交。凝膠中DNA片段的相對(duì)位置在DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜的過(guò)程中繼續(xù)保持著。附著在濾膜上的DNA與32P標(biāo)記的探針雜交，利用放射自顯影術(shù)確定探針互補(bǔ)的每條DNA帶的位置，從而可以確定在眾多酶解產(chǎn)物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。

（1）瓊脂糖凝膠電泳：利用瓊脂糖凝膠電泳可以很容易地將DNA限制酶消化片段（0.3～25kb）分離開(kāi)。分離大分子DNA片段（800～12000bp）用低濃度瓊脂糖（0.7%），分離小分子片段（500～1000bp）用高濃度瓊脂糖（1.0%）,300～5000bp的片段則用1.3%的瓊脂糖凝膠，根據(jù)分離樣品量、分離速度和分辨率要求的不同，可選用不同規(guī)格的電泳槽。

電泳時(shí)，同時(shí)將標(biāo)記物加到旁邊孔中，便于確定樣品DNA的分子量。20伏恒壓電泳過(guò)夜。電泳畢，將膠浸到含0.5μg/ml EB的TBE緩沖液中染色30min，也可將EB直接加到電泳緩沖液中或在配膠前加入膠中，在254nm短波透射燈下拍照，加橙黃色濾色鏡，使用高速一次成像膠片，光圈f4.5,曝光20～40s。

（2）硝酸纖維素濾膜吸印。

①將膠切成合適大小，切去右上角作為記號(hào)。

②將膠放進(jìn)盛有變性緩沖液（1.5mol/l NaCl, 0.5mol/L NaOH）的盤(pán)中輕搖動(dòng)15min。

③換到中和緩沖液（1mol/L Tris·HCl , pH8.0, 1.5mol/L NaCl）中輕搖動(dòng)30min。

④裁一張硝酸纖維素膜，2～4張3MM濾紙和一些吸印紙（可用衛(wèi)生紙），都與膠的大小相同（硝酸纖維素膜和吸印紙不能比膠大，否則易形成旁路），先將硝酸纖維素膜浸到水中，再放入10×SSC中，接觸膠和硝酸纖維素膜時(shí)都要戴橡膠手套操作。

⑤平盤(pán)上放一塊比膠大的平板（盛膠槽翻過(guò)來(lái)即可），上面鋪一張3MM濾紙，起燈芯作用，盤(pán)中加少量10×SSC緩沖液（2.5cm厚），不能沒(méi)過(guò)平板，使3MM濾紙充分飽和。

⑥將膠倒扣到3MM濾紙上。

⑦浸濕的硝酸纖維素鋪在膠上，對(duì)齊，鋪膜時(shí)從一邊逐漸放下，防止產(chǎn)生氣泡，有氣泡時(shí)，可用吸管趕出，不能讓膜與膠下的濾紙直接接觸。

⑧膜上放一張3MM濾紙，不能與膠接觸。

⑨上面加吸印紙及重物（500g左右）。

⑩通過(guò)濾紙的灶芯作用，平盤(pán)中的緩沖液就會(huì)通過(guò)膠上移，從而將DNA吸印到膜上，及時(shí)更換浸濕的吸印紙。在室溫下轉(zhuǎn)印過(guò)夜。

⑾去除上面的東西，用鑷了將膜取出，在6×SSC中洗一下（也可不洗）。

⑿自然干燥，80℃烤2h。

⒀這時(shí)的膜就可進(jìn)行雜交，或室溫密封保存。

Southern印跡雜交技術(shù)

4．Northern印跡雜交（Northern blot）　

這是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。DNA印跡技術(shù)由Southern于1975年創(chuàng)建，稱(chēng)為Southern印跡技術(shù)。RNA印跡技術(shù)正好與DNA相對(duì)應(yīng)，故被趣稱(chēng)為Northern印跡雜交，與此原理相似的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)則被稱(chēng)為western blot。Northern印跡雜交的RNA吸印與Southern印跡雜交的DNA吸印方法類(lèi)似，只是在進(jìn)樣前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA變性，而不用NaOH，因?yàn)樗鼤?huì)水解RNA的2’-羥基基團(tuán)。RNA變性后有利于在轉(zhuǎn)印過(guò)程中與硝酸纖維素膜結(jié)合，它同樣可在高鹽中進(jìn)行轉(zhuǎn)印，但在烘烤前與膜結(jié)合得并不牢固，所以在轉(zhuǎn)印后不能用低鹽緩沖液洗膜，否則RNA會(huì)被洗脫。在膠中不能加EB，因它為影響RNA與硝酸纖維素膜的結(jié)合，為測(cè)定片段大小，可在同一塊膠上加標(biāo)記物一同電泳，之后將標(biāo)記物膠切下，上色、照像。樣品膠則進(jìn)行Northern轉(zhuǎn)印，標(biāo)記物膠上色的方法是在暗室中將其浸在含5μg/ml EB的0.1mol/L 醋酸銨中10min，在水中就可脫色。在紫外光下用一次成像相機(jī)拍照時(shí)，上色的RNA膠要盡可能少接觸紫外光，若接觸太多或白熾燈下暴露過(guò)久，會(huì)使RNA信號(hào)降低。從瓊脂糖凝膠中分離功能完整的mR－NA時(shí)，甲基氫氧化汞是一種強(qiáng)力、可逆變性劑，但是有毒，因而許多人喜用甲醛作為變性劑。操作均應(yīng)避免RNase的污染。

下面介紹RNA甲醛凝膠電泳和吸印方法：

（1）試劑

10×MSE緩沖液：0.2mol/L 嗎啉代丙烷磺酸（MOPS），pH7.0, 50mmol/L 醋酸鈉，1mmol/l EDTA, pH8.0。

5×樣品緩沖液：50%甘油，1mmol/l EDTA, 0.4%溴酚藍(lán)。

甲醛：用水配成37%濃度（12.3mol/L）。應(yīng)在通風(fēng)柜中操作，pH高于4.0。

去離子甲酰胺。

50mmol/L NaOH(含10mmol/l NaCl)。

0.1mol/L Tris·HCl,Ph7.5。

（2）步驟

①40ml水中加7g瓊脂糖，煮沸溶解，冷卻到60℃，加7ml 10×MSE緩沖液、11.5ml甲醛，加水定容 至70ml，混勻后 倒入盛膠槽。

②等膠凝固后，去掉梳子和膠布，將盛膠槽放入1×MSE緩沖液的電泳槽。

③使RNA變性（多20μg）：RNa 4.5μl，10×MSE緩沖液2.0μl，甲醛3.5μl，去離子甲酰胺10.0μl。

④55℃加熱15min，冰浴冷卻。

⑤加2μl 5×載樣緩沖液。

⑥上樣，同時(shí)加RNA標(biāo)記物。

⑦60伏電泳過(guò)夜。

⑧取出凝膠，水中浸泡2次，每次5min。

⑨室溫下將膠浸到50mmol/L NaOH和10mmol/l NaCl中45min，水解高分子RNA，以增強(qiáng)轉(zhuǎn)印。

⑩室溫下將膠浸到0.1mol/L Tris·HCl (Ph7.5)中45min，使膠中和。

⑾20×SSC洗膠1h。

⑿20×SSC中過(guò)夜，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。

⒀取出硝酸纖維膜，80℃真空烘烤2h。

5．組織原位雜交（Tissue in situ hybridization）　

組織原位雜交簡(jiǎn)稱(chēng)原位雜交，指組織或細(xì)胞的原位雜交，它與菌落的原位雜交不同。菌落原位雜交需裂解細(xì)菌釋出DNA，然后進(jìn)行雜交。而原位雜交是經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交。因此原位雜交可以確定探針的互補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置，這一點(diǎn)具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。例如，對(duì)致密染色體DNA的原位雜交可用于顯示特定的序列的位置；對(duì)分裂期間核DNA的雜交可研究特定序列在染色質(zhì)內(nèi)的功能排布；與細(xì)胞RNA的雜交可分析任何一種RNA在細(xì)胞中和組織中的分布。此外，原位雜交還是顯示細(xì)胞亞群分布和動(dòng)向及病原微生物存在方式和部位的一種重要技術(shù)。

用于原位雜交的探針可以是單鏈或雙鏈DNA，也可以是RNA探針。通常探針的長(zhǎng)度以100～400nt為宜，過(guò)長(zhǎng)則雜交效率減低。近研究結(jié)果表明，寡核苷酸探針（16～30nt）能自由出入細(xì)菌和組織細(xì)胞壁，雜交效率明顯高于長(zhǎng)探針。因此，寡核苷酸探針和不對(duì)稱(chēng)PCR標(biāo)記的小DNA探針或體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記的RNA探針是組織原位雜交的優(yōu)選探針。

探針的標(biāo)記物可以是放射性同位素，也可以是非放射性生物素和半抗原等。放射性同位素中，3H和35S為常用。3H標(biāo)記的探針半衰期長(zhǎng)，成像分辨率高，便于定位， 缺點(diǎn)是能量低。35S標(biāo)記探針活性較高，影像分辨率也較好。而32P能量過(guò)高，致使產(chǎn)生的影像模糊，不利于確定雜交位點(diǎn)。

原位雜交中，標(biāo)本的固定條件是影響雜交效率的重要因素，標(biāo)本組織蛋白質(zhì)的消化程度對(duì)探針進(jìn)入細(xì)胞極為重要。去除蛋白的方法是，用0.2mol/l HCl處理載玻片，用蛋白酶K消化，然后用不同濃度的乙醇脫水，原位雜交還是一種新技術(shù)，發(fā)展很快，在敏感性、特異性和穩(wěn)定性上還需要進(jìn)一步完善和提高（詳見(jiàn)二十章　）。

6．固相夾心雜交　　

Dunn等早介紹了夾心雜交類(lèi)型，Ranki等又作了進(jìn)一步的改進(jìn)。夾心雜交法比直接濾膜雜交法有兩個(gè)主要的優(yōu)點(diǎn)：①樣品不需要固定，對(duì)粗制樣品能做出可靠的檢測(cè)；②用夾心雜交法比直接濾膜雜交法特異性強(qiáng)，因?yàn)橹挥袃蓚€(gè)雜交物都雜交才能產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。

固相夾心雜交需要兩個(gè)靠近而不互相重疊的探針，一個(gè)作固相吸附探針，另一個(gè)作標(biāo)記檢測(cè)探針。樣品基因組內(nèi)核酸只有使這兩個(gè)探針緊密相連才能形成夾心結(jié)構(gòu)。需注意的是兩個(gè)探針必須分別亞克隆進(jìn)入兩個(gè)分離的非同源載體內(nèi)，以避免產(chǎn)生高的本底信號(hào)（如一個(gè)克隆人Puc19,另一克隆人pBR322）。

夾心雜交法可用濾膜和小珠固定吸附探針，使用小珠可更好地進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化試驗(yàn)和更容易對(duì)小量樣品進(jìn)行操作。Dahlen 等利用微孔板進(jìn)行夾心雜交，可同時(shí)進(jìn)行大量樣品檢測(cè)，他們先吸取DNA探針加到凹板中，然后用紫外線(xiàn)照射使其固定到塑料板上。用微孔板進(jìn)行夾心雜交還可直接用于PCR技術(shù)。應(yīng)用光敏生物標(biāo)記探針檢測(cè)PCR產(chǎn)物的敏感性和用32P標(biāo)記探針（3×108cpm/μg）作16h放射自顯影的Southern雜交的敏感性一樣。用微孔板雜交的其它優(yōu)點(diǎn)還包括同時(shí)做多份樣品，加樣、漂洗和讀結(jié)果等步驟可以自動(dòng)化。

7．其它雜交類(lèi)型

（1）固化探針雜交：

該法較少使用，原理是使未標(biāo)記固化探針通過(guò)雜交與靶RNA或DNA結(jié)合，漂洗后，用酶標(biāo)抗DNA：RNA抗體或抗DNA：DNA抗體與雜交物結(jié)合。將乳膠顆粒收集，吸附到膜上后漂洗，加入底物顯色并進(jìn)行測(cè)定。探針濃度2μg/ml,80℃雜交，可在10～15min完成，檢測(cè)的敏感性為5×108靶序列。

（2）反向雜交：這個(gè)雜交類(lèi)型是用標(biāo)記的樣品核酸與未標(biāo)記的固化探針DNA雜交，故稱(chēng)為“反向雜交”。這種雜交方法的優(yōu)點(diǎn)是在一次雜交反應(yīng)中，可同時(shí)檢測(cè)樣品中幾種核酸 。這種雜交方式主要用于進(jìn)行中的核酸轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)和多種病原微生物的檢測(cè)。前者是在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中標(biāo)記RNA探針，后者可用光敏生物素制劑BPA標(biāo)記樣品核酸。

（三）固相膜核酸雜交的幾點(diǎn)說(shuō)明

1．雜交膜的選用　　

雜交膜是一種多孔、表面積很大的固相載體，核酸一旦固定在上面，就可用雜交法進(jìn)行檢測(cè)。常使用的膜是硝酸纖維素膜，用于放射性和非放射笥標(biāo)記探針都很方便，產(chǎn)生的本底淺，與核酸結(jié)合的化學(xué)性質(zhì)不是很清楚，推測(cè)為非共價(jià)鍵結(jié)合。經(jīng)80℃烤干2h或在紫外交聯(lián)儀輻照等雜交處理后，核酸仍不會(huì)脫落。硝酸纖維素膜的另一特點(diǎn)是只與蛋白有微弱非特異結(jié)合，這在使用非同位素探針中尤為有用。硝酸纖維素膜的缺點(diǎn)是結(jié)合核酸能力的大小取決于轉(zhuǎn)印條件和高濃度鹽（＞10×SSC），與小片段核酸（＜200bp）結(jié)合不牢，質(zhì)地脆，不易操作。

尼龍膜在某些方面比硝酸纖維素膜好，它的強(qiáng)度大、耐用，可與小至10bp的片段共價(jià)結(jié)合。在低離子濃度緩沖液等多種條件下，它們都可與DNA單鏈或RNA緊密結(jié)合，且多數(shù)膜不需燒烤。尼龍膜韌性好，可反復(fù)處理與雜交，而不丟失被檢標(biāo)本。它通過(guò)疏水鍵和離子鍵與核酸結(jié)合，結(jié)合力為350～500μg/cm2，比硝酸纖維素膜（80～100μg/cm2）強(qiáng)許多。尼龍膜的缺點(diǎn)是對(duì)蛋白有高親合力，不宜使用非同位素探針。

2．“噪音”的排除　　

“噪音”（noise）是固相膜雜交方法常遇到的問(wèn)題，指標(biāo)記DNA結(jié)合到空白膜上的放射性計(jì)數(shù)，即本底。這個(gè)問(wèn)題的克服一是使用高純度的核酸制品和充分嚴(yán)格的雜交條件：二是選擇合適的雜交反應(yīng)液和對(duì)膜進(jìn)行處理。研究發(fā)現(xiàn)，隨著離子強(qiáng)度的增加，空白膜（未固定DNA對(duì)照膜）上的“噪音”水平增加，而在50%甲酚胺6×SSC的雜交反應(yīng)液中充分封閉膜上的多余非特異結(jié)合位點(diǎn)。

（四）液相核酸分子雜交類(lèi)型

1．吸附雜交

（1）HAP吸附雜交：羥基磷灰石（HAP）層析或吸附是液相雜交中早使用的方法。在液相中雜交后，DNA：DNA雜交雙鏈在低鹽條件可特異地吸附到HAP上。通過(guò)離心使吸附有核酸雙鏈的HAP沉淀，再用緩沖液離心漂洗幾次HAP，然后將HAP置于計(jì)數(shù)器上進(jìn)行放射性計(jì)數(shù)。

（2）親合吸附雜交：生物素標(biāo)記DNA探針與溶液中過(guò)量的靶RNA雜交，雜交物吸附到酰化親合素包被的固相支持物（如小球）上，用特異性抗DNA：RNA雜交物的酶標(biāo)單克隆抗體與固相支持物上的雜交物反應(yīng)，加入酶顯色底物，這個(gè)系統(tǒng)可快速（2h）檢測(cè)RNA。

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